本《医学免疫学实习指导》根据教育部《高等医学院校系统解剖学教学大纲》的要求编写，教材突出基础理论、基本知识和基本技能。本实验课程由以下板块构成：基本实验操作方法及常用器械、仪器使用占总内容的10%，基本实验或经典验证性实验占总内容的70%，综合设计性实验占总内容的10%，研究创新性实验占总内容的10%。每个实验项目包括实验的目的与要求、实验标本与模型、实验内容与方法、思考题等。其目的是指导学生根据实验内容进行实验操作，以便实验师生课前做好准备。每个实验项目后配有相应的思考题，便于学生复习，检测学生对所学知识的掌握程度。思考题部分包括名词解释、选择题、填空题和问答题四种常用题型，与课程结业考试题型一致，并附有参考答案。通过练习及解答帮助学生有效地回顾、复习和总结所学的知识，开阔思路，提高学生自主学习、提出问题、分析问题、解决问题以及临床思维的能力。
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《医学免疫学实验》适用于医学院校本科临床、基础等专业教学使用。9787030434760
目录
第一章 动物实验的基本操作 1
第一节 实验动物的抓取同定 1
第二节 动物实验注射给药法 3
第三节 动物实验的采血方法 5
第四节 实验动物的处死方法 7
第二章 免疫学常用实验仪器 9
第一节 酶标仪 9
第二节 流式细胞仪 10
第三节 酶联斑点分析仪(ELISPOT分析仪) 11
第四节 低温水平离心机 12
第五节 电泳仪 14
基本实验
第三章 非特异性免疫实验 16
第一节 溶菌酶的溶菌作用 16
第二节 补体参与的实验 17
第三节 吞噬细胞的吞噬作用及吞噬杀菌功能测定 21
第四节 NK细胞功能测定 25
第四章 免疫细胞的分离及功能检测 29
第一节 免疫细胞的分离 29
第二节 细胞免疫功能的检测 42
第三节 体液免疫功能的评价 49
第五章 经典抗原抗体反应 52
第一节 凝集反应 52
第二节 沉淀反应 59
第六章 免疫标记技术 69
第一节 免疫酶技术 69
第二节 免疫荧光技术 74
第三节 放射免疫测定技术 77
第四节 兔疫胶体金技术 78
第七章 细胞因子的检测 82
第一节 细胞因子检测方法概述 82
第二节 常见细胞因子的检测 82
第八章 细胞凋亡的检测 89
第一节 细胞凋亡的形态学研究方法 89
第二节 细胞凋亡的生物化学研究方法 93
第三节 流式细胞术检测细胞凋亡的常用方法 98
综合性实验
第九章 抗体制备技术 104
第十章 免疫印迹 111
第十一章 免疫共沉淀 115
第十二章 免疫PCR技术 117
第十三章 HLA分型技术 120
第十四章 超敏反应动物模型 123
创新性实验
第十五章 肺结核患者外周血中Th1/Th2细胞亚群的鉴定和分析 127
第十六章 血清中流感病毒中和抗体的检测 129
附录 常用试剂和溶液的配制 133
参考文献 140
第一章 动物实验的基本操作
动物实验是免疫学实验中的一种基本实验技术。动物实验的基本操作包括实验动物的抓取固定、标记编号、注射给药、取血及处死方法等。
第一节 实验动物的抓取固定
实验动物的抓取固定方法依实验内容和动物的种类而定。正确的抓取固定动物，既可防止被动物咬伤，又不损害动物健康，有利于实验顺利完成。抓取固定动物前，要了解各种动物的一般习性。抓取固定时，要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确，同时要爱惜动物，使动物少受痛苦，不能粗暴恐吓动物。
一、小鼠抓取固定
小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其他粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心，无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定(图1-1)。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定，如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作，如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行实验。
二、大鼠的抓取固定
大鼠比小鼠牙尖性猛，可带上帆布手套抓取，避免被咬伤。进行灌胃，腹腔、肌肉及皮下注射时，可采用左手固定法：用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指紧捏鼠背皮肤，置于左掌心中，右手进行实验操作；也可伸开左手之虎口，敏捷地从后面一把抓住(图1-2)。做手术时，事先麻醉或处死，然后用细棉线绳活缚腿，背卧位绑在大鼠固定板上；尾静脉注射时用大鼠固定盒固定即可。
三、豚鼠的抓取与固定
豚鼠胆小易惊，抓取必须稳、准、迅速。一般先用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，另一只手托住臀部(图1-3)。
另一种抓取方法是：把左手的食指和中指放在颈背部的两侧，拇指和无名指放在肋部，分别用手指夹住左右前肢，抓起来。然后翻转左手，用右手的拇指和食指夹住右后肢，用中指和无名指夹住左后肢，使鼠体伸直成一条直线。不能抓豚鼠腰腹部，否则易造成肝破裂。固定的方式基本同大鼠。
四、兔的抓取固定
一般以右手抓住兔颈部的毛皮提起，左手托其臀部或腹部，让其大部分体重集中在左手上(图1-4)，可避免动物的损伤。不能抓双耳或抓提腹部。
家兔的固定一般分为盒式固定和台式固定(图1-5)。其中盒式固定适用于兔耳采血、耳血管注射等情况；台式固定适用于手术时：动物仰卧，四肢用粗棉绳活结绑住，拉直四肢，将绳绑在兔台四周的固定棒上，头以固定夹固定或用一根粗棉绳挑过兔门齿绑在兔台铁 柱上。
图1-5 家兔的盒式固定与台式固定
第二节 动物实验注射给药法
一、腹 腔 注 射
腹腔注射部位为下腹部腹中线左右两侧1cm处，为避免伤及内脏，抓取固定动物时应使头稍向后低，使内脏移向上腹(图1-6)。局部消毒后，右手持注射器将针头刺入皮肤，针头到达皮下后，稍向前推，再以45°刺入腹腔，回抽无回血或液体方可注入药液。腹腔注射通常均选取5号针头。大鼠、小鼠、豚鼠腹腔注射时一般以左手固定动物，右手注射；对体重较大的大鼠或豚鼠、家兔等大动物，可由助手固定动物，暴露腹部，另一人进行注射操作。
二、皮 下 注 射
一般选择皮下组织较疏松的部位注射。大鼠、小鼠、家兔、犬等注射部位有颈背、腋下、侧腹和后肢，猪为耳根部皮下，鸡为翼下部位。局部消毒，注射者将皮肤提起，将注射针头刺入皱褶底部，沿体轴推进5~10mm，若针尖易左右摆动，表明已刺入皮下，回抽无回流物即可注射，皮下呈扩散状隆起。注射完毕，干棉球局部压迫，防注液外漏。小鼠用4号针头，家兔等用6号针头。
三、皮 内 注 射
大鼠、小鼠、豚鼠、家兔等动物皮内注射常选择背部脊柱两侧的皮肤。猪选取耳壳外面或腹侧皮肤注射。局部去毛、消毒，用左手将皮肤捏成皱襞，右手持针，将针头与皮肤约成30°角刺入皮下，使针头向上挑起并稍刺入，即可注射(图1-7)，注射部位鼓起一小丘。
四、肌 内 注 射
大鼠、小鼠、家兔、犬等一般选择肌肉丰满而无大血管通过的臀部、大腿内外侧肌内注射。局部消毒，使注射针与肌肉约成60°角，迅速刺入肌肉，回抽无回血方可进行注射(图1-8)。大鼠和小鼠选用5号针头，家兔、猫、犬选用6号针头。
五、静 脉 注 射
1. 大鼠、小鼠尾静脉注射 大鼠、小鼠尾部有四根血管，其中腹侧的一根为动脉，背部的一根为静脉，两侧各有一根静脉。两侧静脉较易固定，用来静脉注射。先固定，暴露尾部，使血管扩张，用左手无名指从下面托起尾巴，以拇指和小拇指夹住尾巴的末梢，右手持4号注射针，从尾末端沿与静脉平行方向进针，针头刺入后轻推药液，若无阻力，表示针头已在静脉中，可继续缓缓推入药液；若轻推药液后阻力较大，且有白色隆起，说明注射到皮下，需拔出针重新刺入。注射完毕用干棉球按压止血或把尾巴向注射侧弯曲以止血(图1-9)。
2. 豚鼠背中足静脉注射 固定动物，找到静脉，局部剪毛，消毒(为方便注射甚至可剪破皮肤)，右手持4号注射针沿向心方向刺入血管，回抽有回血即可注射，注射后干棉球压迫止血，胶布包裹伤口。
也可耳缘静脉注射。耳缘静脉较细注射难度大，固定很重要。操作者先使静脉充盈，用左手食指和中指夹住静脉近心端，拇指和小指夹住耳边缘部分，无名指和小指在耳下作垫，右手持4号注射针从静脉末端顺血管平行方向刺入，回抽如有回血，放松对耳根部血管的压迫，固定针头缓慢注入药液。
3. 家兔耳缘静脉注射 将兔盒式固定，找到耳缘静脉，拔去局部被毛，酒精擦拭使血管充盈。注射、止血方法与豚鼠基本相同。若注射成功，注射器针栓可轻松推动，可见药液在血管内流动(图1-10)。
图1-9 小鼠尾静脉注射 图1-10 家兔耳缘静脉注射
第三节 动物实验的采血方法
一、小鼠和大鼠的采血方法
1. 割(剪)尾采血 固定，尾部用45~50℃的温水或酒精擦拭，使尾静脉充盈扩张。消毒，割去尾尖1~2mm (小鼠)或3~5mm(大鼠)，让血液自由滴入试管或用血红蛋白吸管吸取(图1-11)。采血结束，伤口消毒，棉球压迫止血。或在尾部做一横切口，割破尾动脉或静脉收集血液。取血量少，小鼠0.1mL/次，大鼠0.3~0.5mL/次。每只鼠可采血10次 以上。
2. 尾静脉穿刺采血 固定，充盈尾静脉，消毒，注射针沿与静脉平行方向，从尾末端进针穿刺，抽取血液。
3. 眼眶后静脉丛采血 将取血管浸入1%肝素，干燥后使用。操作者一手固定动物，拇指和食指尽量将鼠头部皮肤捏紧，或轻轻压迫颈部两侧，使鼠眼球突出，眶后静脉丛充血，另一只手持取血管，以45°角从内眼角刺入，深度为小鼠2~3mm，大鼠4~5mm。当感到有阻力时即停止推进，将针退出0.1~0.5mm，边退边抽。采血后，去颈部压力，拔出采血管。可短期内重复采血，采血量小鼠为0.2~0.3mL/次，大鼠0.5~1.0mL/次。
4. 摘眼球法 左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子或止血钳在眼球根部迅速摘除眼球，眼眶内很快流出血液(图1-12)。
图1-12 小鼠摘眼球取血
5. 断头采血 采血者左手的拇指和食指从背部握住鼠的颈部皮肤，用剪刀迅速剪掉头部，立即将头朝下，提起动物，血液即流入试管中。采血量小鼠为0.8~1.2mL，大鼠5~10mL。
6. 颈(股)动静脉采血 将鼠麻醉，剪去一侧颈部外侧被毛，做颈动静脉分离手术，用注射器采血即可。
二、豚鼠采血法
1. 耳缘剪口采血 使耳充血，消毒，用锐器割破耳缘，切口边缘涂抹20%枸橼酸钠，阻止血凝，血自切口自动流出进入盛器。每次采血约0.5mL。
2. 心脏采血 可由助手握住前后肢进行采血。选心脏搏动最强部位进针穿刺，血液即流入针管。针头宜细长，以免术后穿刺孔出血。
3. 股动脉采血 固定，剪去腹股沟被毛，局部麻醉，切开长2~3cm的皮肤，钝性分离软组织，暴露并游离出1~2cm的股动脉。用镊子提起股动脉，远心端结扎，近心端用止血钳夹住，在动脉壁中央剪一小孔，插入采血细管，放开止血钳，血液即可流出。一次可采血10~20mL。
4. 背中足静脉取血 助手固定动物，伸直膝关节。术者消毒脚背面，以左手拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手持注射针刺入静脉取血，完毕后用棉球压迫止血。
三、兔 采 血 法
1. 耳缘静脉采血 固定，局部去毛，用手指摩擦兔耳，使静脉扩张，消毒，在耳缘静脉末端刺破血管待血液漏出取血，或将针头逆血流方向刺入耳缘静脉取血，完毕，用棉球压迫止血，一次最多采血5~10mL，可反复取血。
2. 兔耳中央动脉采血 兔耳中央较粗、颜色鲜红的为中央动脉。先使兔耳充血，左手固定兔耳，右手持6号针头注射器从动脉末端沿与血管平行地向心方向刺入，即可见动脉血进入针筒，取血完毕后注意止血。一次约采血15mL。
3. 心脏取血 固定，剪去左胸部兔毛，消毒。在胸骨左缘第3、4肋骨间心尖搏动最强处垂直刺入心脏，血液可自动泵入注射器。若针头已进入心脏但抽不出血时，可以前后进退调节针头的位置，切不可使针头在胸腔内左右摆动以防止伤及心、肺。一次可取血20~25mL，6~7天后可重复采血。也可用50mL注射器(16号针头)心脏一次抽血致死。
4. 后肢胫部皮下静脉取血 固定，拔去胫部被毛，在胫部上端股部扎橡皮管，在胫部外侧浅表皮下可见到皮下静脉。用左手拇指、食指固定好血管，右手持注射器(5号针头)与静脉平行进针，抽血有回血即可采血。采血完毕后用棉球压迫止血，此处不易止血，压迫时间应稍长。一次可采血2~5mL。
5. 大血管采血
(1) 颈外静脉采血：将兔台式固定，充分暴露颈部。用左手朝心端绷紧颈部皮肤，右手持注射器沿颈部平行方向朝头端方向刺入，有回血后，固定好注射器，缓慢采血。一次可取血10mL以上。取血完毕，用干纱布压迫止血。
(2) 股动脉、股静脉采血：固定后，左手扪股三角区，触及动脉搏动部位，尽量由远心端进针，向近心端方向穿刺，刺中可见血液流入针筒。如采静脉血，在扪到动脉搏动的部位进针后，当针头触及索状感股动脉时，将针头稍朝内侧移动，再迅速穿刺，即可穿刺到股静脉。采血完毕，用棉球压迫止血。
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