《医学免疫学实验》包括46 个实验，涵盖基础免疫学实验、临床免疫学实验及设计性实验三部分内容。基础免疫学实验是《医学免疫学实验》重点介绍的内容，按照实验动物、
免疫细胞和免疫分子实验的逻辑顺序编写。实验动物部分既包括了传统的实验动物基本操作、免疫相关动物模型的建立，同时也增加了常用的转基
因、基因突变或基因敲除小鼠特点的介绍。免疫细胞实验部分包括免疫细胞分离、分选及功能检测，同时将流式细胞术的分析、分选技术融入相关
实验内容。免疫分子实验部分包括了经典的抗体、补体和细胞因子的检测方法，并介绍了Real-time PCR、流式细胞术等免疫新技术。临床免疫学实
验部分结合临床检验，使用胶体金斑点层析技术、化学发光技术等检测临床早期妊娠、肿瘤标志物等。设计性实验注重对学生综合能力的培养，使
其掌握独立设计综合性实验的能力。《医学免疫学实验》注重将基础实验与临床实验结合、新理论与新技术结合、验证性实验与综合设计性实验结合，内容丰富。
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目录
前言
第一章 实验动物基本操作 1
实验一 实验动物的抓取与同定方法 1
实验二 实验动物的给药方法 4
实验三 实验动物的采血方法 7
第二章 免疫相关疾病动物模型建立 1 1
实验一 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的建立 11
实验二 大鼠佐剂性关节炎模型的建立 14
实验三 家兔Masugi肾炎模型的建立 1 6
实验四 小鼠过敏性哮喘模型的建立 19
第三章 免疫学常用小鼠品系 21
一、免疫学常用的野生型近交系小鼠 21
二、免疫学常用的转基因、基因突变或基因敲除小鼠 22
第四章 细胞培养基本操作 33
一、体内、体外细胞的差异和分化 33
二、体外培养细胞的分型 33
三、培养细胞的生长和增殖过程 34
实验一 细胞培养器材的准备与无菌操作 36
实验二 原代细胞培养 41
实验三 细胞传代培养 44
实验四 细胞冻存与复苏 46
实验五 细胞计数与活力测定 48
第五章 免疫细胞的分离与制备 52
实验一 人外周血单个核细胞的分离 52
实验二 小鼠腹腔巨噬细胞的分离 55
实验三 人外周血NK绌胞的分离 57
实验四 小鼠骨髓树突状细胞的制备 61
实验五 小鼠CD4+T淋巴细胞的分离 64
实验六 小鼠脾B细胞的分离 66
第六章 免疫细胞功能检测 69
实验一 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 69
实验二 51Cr释放法检测NK细胞杀伤活性的测定 71
实验三 细胞毒性T细胞功能测定 73
实验四 树突状细胞对CD4+T细胞的活化和增殖作用检测 75
实验五 树突状细胞诱导CD4+T细胞分化作用检测 78
实验六 调节性T细胞免疫抑制功能实验 81
实验七 免疫细胞凋亡检测 84
实验八 免疫印迹法检测免疫细胞信号蛋白ERK活化 92
第七章 抗体的人工制备 98
实验一 多克隆抗体的制备 98
实验二 单克隆抗体的制备 100
第八章 经典抗原抗体反应 104
实验一 直接凝集反应 104
实验二 间接凝集试验 108
实验三 单向琼脂扩散实验 110
实验四 双向琼脂扩散实验 112
实验五 溶血空斑实验 114
第九章 细胞因子检测 117
实验 ELISA双抗夹心法检测细胞因子 117
实验二 ELISOPT检测细胞因子 119
实验三 FACS检测细胞因子 121
实验四 Real time PCR检测细胞因子 123
实验五 小鼠干扰素诱导的抗病毒活性的检测 130
实验六 趋化实验检测趋化因子的趋化功能 132
第十章 临床免疫学实验 135
实验一 豚鼠速发型超敏反应 135
实验二 血清总IgE水平测定 136
实验三 结核菌素试验 138
实验四 化学发光免疫分析技术检测肿瘤标志物 140
实验五 酶联免疫吸附试验检测乙肝五项指标 141
实验六 免疫荧光技术检测抗核抗体 143
实验七 胶体金斑点层析技术检测早期妊娠 145
第十一章 设计性实验 147
一、设计性实验的选题、设计与实施 147
二、参考范例 151
主要参考文献 154
实验动物基本操作
实验动物是生命科学研究的基础和条件，而动物实验是现代生命科学研究的一个重要手段。免疫学实验中，常根据实验目的和要求的不同选用不同的动物。免疫学常见的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和绵羊等。本章介绍动物实验的几种基本操作，包括实验动物的抓取、固定、给药、采血等，这些基本操作是免疫学实验中经常用到的，掌握的熟练程度将直接影响实验能否顺利进行。
实验一 实验动物的抓取与固定方法
实验动物的抓取与固定是动物实验操作技术中昀基本又很重要的一项基本技能。在进行实验时，为了不损伤动物的健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，抓取动物前，要限制动物的活动，使动物处于安静状态。工作人员必须对各种动物的一般习性有所了解，掌握合理的抓取和固定方法。具体方法根据实验内容和动物种类而定。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时要爱惜动物，使动物少受痛苦。
【实验目的】
掌握小鼠与大鼠的抓取和固定，熟悉豚鼠的抓取和固定，了解家兔的抓取与固定。
【实验方法】
1. 小鼠的抓取和固定
（1）从鼠笼盒内将小鼠尾部捉住并提起，放在笼盖（或表面粗糙的物体）上，轻轻向后牵拉鼠尾（图 1-1A）。
（2）在小鼠向前挣脱时，用左手（熟练者也可用同一只手）拇指和示指抓住两耳和颈部皮肤（图 1-1B），环指、小指和手掌心夹住背部皮肤和尾部，并调整好动物在手中的姿势（图 1-1C）。右手即可进行各种操作，如皮下、肌肉和腹腔注射、灌胃，以及其他实验操作。
图 1-1小鼠的抓取
（3）如进行解剖手术和心脏采血等操作，均可使动物先取背卧式（必要时先进行麻醉），再用大头针或线绳将鼠前后肢依次固定在木板上。
（4）尾静脉取血或尾静脉注射时，可用小鼠尾静脉注射架固定（图 1-2）；或倒放入适当大小和重量的容器，把小鼠放在里面只露尾巴，这种容器能够压住尾部不让其活动，同时可起到驱赶血液的作用。
图 1-2小鼠尾静脉注射架
2. 大鼠的抓取与固定
大鼠的门齿很长，在抓取方法不当而受到惊吓或激怒时易将操作者手指咬伤，所以不要采取突然袭击式的抓取方法，实验者应戴上防护手套（有经验者也可不戴），右手轻轻抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮肤脱落。左手抓紧大鼠两耳和头颈部的皮肤，并将大鼠固定在左手中，右手则可进行操作（图 1-3）。根据实验需要也可进行板式固定或盒式固定，固定方法同小鼠，但固定器材较小鼠大些。
图 1-3大鼠的抓取
3. 豚鼠的抓取与固定
豚鼠胆小易惊，抓取时必须稳、准、迅速。先用手掌扣住鼠背，抓住其肩胛上方，将手张开，用手环握住颈部，另一只手托住其臀部，即可轻轻提起、固定（图 1-4）。其固定方法基本同大鼠。
图 1-4豚鼠的抓取
4. 家兔的抓取和固定
从笼中抓取家兔时，先轻轻打开笼门，勿使其受惊，随之将手伸入笼内，从头前阻拦，兔便匍匐不动。此时用右手把两耳轻压于手心内，抓住颈部的被毛和皮，即可提起兔，然后用左手托住其臀部（图 1-5A）或者托住其腹部（图 1-5B），兔身的重量大部分落入左手上。切忌用手抓家兔的两耳，实验工作中家兔耳部常被用来进行采血、静脉注射等，所以家兔的两耳应尽量保持不受损伤。需要进行手术时，可将家兔固定在兔实验台上，固定四肢，门齿用细绳拴住。另外还有盒式固定法，可进行耳缘静脉注射或采血等操作。
图 1-5家兔的抓取
【注意事项】
1. 动物处于惊吓中勿进行任何操作，可等待片刻，待其安静。
2. 抓取动物切勿犹豫，应该胆大心细，速度要快。
3. 抓取小鼠要注意抓紧其颈部皮肤，使其头部不能转动，可预防被其咬伤，但切记不可太久，以免引起窒息死亡。
【思考题】
小鼠抓取过程中如何预防被其咬伤？
实验二 实验动物的给药方法
在动物实验中，为了观察药物引起的机体功能、代谢及形态等变化，常需要将药物注入动物体内。给药的途径和方法多种多样，可根据不同的实验目的、实验动物和药物剂型、剂量等进行确定。
【实验目的】
掌握小鼠的腹腔注射、灌胃和尾静脉注射给药方法；熟悉小鼠的其他给药方法；了解家兔的给药方法。
【实验方法】
1. 皮下注射给药
皮下注射给药是将药液推入动物皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。
操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后用左手拇指和示指轻轻提起皮肤，右手持注射器，针头取一钝角角度刺入皮下，然后将针头轻轻向左右摆动，如针头易摆动则表示已刺入皮下，再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢将药物注入皮下。拔针时，左手拇指、示指捏住进针部位片刻，以防止药物外漏。小鼠注射部位常选腹部两侧或背部的皮肤（图 1-6A），豚鼠取腹部和大腿内侧，家兔取背部大腿内侧或耳根部。小鼠注射量为 0.2～0.5ml，家兔和豚鼠注射量为 0.5～1.0ml。
2. 皮内注射给药
皮内注射给药是将药液注入皮肤的表皮和真皮之间，观察皮肤血管的通透性变化或皮内反应。接种、过敏实验等一般做皮内注射。
将注射部位的被毛剪掉，局部常规消毒，左手拇指和示指按住皮肤使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连接 4.5号针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向上挑起并稍刺入，将药液注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘，注射后 5s再拔出针头，否则药液会从针孔流出。雄性动物皮肤紧密，皮内注射时较雌性动物难度大。做皮内注射常选项背的皮肤（图 1-6B），注射量为每次 0.1～0.2ml。
3. 肌内注射给药
肌内注射给药应选择肌肉发达、无大血管通过的部位。
针头直接刺入肌肉，回抽针栓如无回血即可注射。小鼠体积小，肌肉少，很少采用肌内注射。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时，采用肌内注射，注射部位多选大腿部肌肉（图 1-6C），注射量每腿不超过 0.1ml。家兔、豚鼠多选臀部、大腿内侧或外侧，注射量不超过 2.0ml。
图 1-6小鼠的皮内、皮下和肌内注射给药
4. 灌胃给药
固定动物，使其头、颈和身体呈一直线。灌胃针头从嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有一个落空感，进入后就可以推注药液了。如遇阻力，应退出后重插，不能强力插，以免穿破食管或误入气管。每只小鼠的灌胃昀大容积不超过 0.8ml（图 1-7A）。
5. 腹腔注射给药
用左手捕捉固定动物，使其腹部向上，鼠头略低于尾部，右手将注射针头自下腹部靠近腹白线的稍左侧或右侧刺入皮下，使针头向前推 0.5～1.0cm，再以 45°角穿过腹肌刺向腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液和血液后缓慢注入药液。注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。小鼠腹腔注射的给药量为
0.5～1.0ml（图 1-7B）。家兔等较大动物注射应先固定，于腹部中线旁侧 1cm注射，注射量为 5.0ml。
6. 尾静脉注射给药
（1）小鼠：固定小鼠后，采用 75%酒精棉球擦拭的方法或者温水浸泡的方法使小鼠的血管充盈。若小鼠的血管很不清楚，推荐采用温水浸泡的方法，水温以不烫手为宜。温水浸泡 2～3min后，取出小鼠尾巴，用干棉球擦拭，待血管充盈，用酒精棉球擦拭后就可以进针了。若血管还未充盈，可反复用温水浸泡。选择血管，小鼠尾部有 2条动脉和 3条静脉， 2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面， 3条静脉呈“品”字形分布，一般认为左右的 2条静脉比较容易注射。一般要求进针部位靠近小鼠的尾端，这样若注射失败，还可再向上选择进针点。但是进针部位不能太靠下，因越往下静脉越细，操作越困难，一般以小鼠尾巴下 1/3的位置为宜。进针时操作者左手示指和拇指固定住小鼠的尾巴，让小鼠的尾巴在经过拇指后向下弯曲，进针点靠近拇指指甲。针头和血管呈约 30°角，针尖斜面朝上，轻轻挑刺入皮肤后针头立即和血管平行，可将针头刺入血管多半（图 1-7C）。正常情况下，推注的过程应无明显阻力，血管也不鼓起。推注药液时动作宜轻柔，若发现血管鼓起，则表明针头未刺入血管，需立即拔出针头。拔出针头后，用拇指按注射部位 1～2min，防止出血。
图 1-7小鼠的灌胃、腹腔和尾静脉注射给药
（2）家兔：将手伸入兔笼内，于兔头前阻拦其跑动，当其匍匐不动时，右手抓住颈部皮肤，将兔提起，左手随之托住其臀部。将家兔按于桌上，一手轻轻按其颈部，一手轻挟耳根，使耳向前。剪去耳缘被毛，用酒精棉球轻轻按摩耳翼，压迫耳根部静脉，使耳缘静脉扩张（图 1-8A）。用左手拇指与中指、示指抓住耳尖部，右手从耳尖部边缘平行进针（图 1-8B），试推少量注射液，如果感觉无阻力，局部也无隆起、血管变色，表示已进入静脉，可将注射液缓缓注入。若注射有误，则注射时阻
图 1-8家兔耳缘静脉注射给药
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